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透射电镜自噬小体检测

胰酶-，收集作用后的细胞，离心，先将细胞块固定在2.5%成二醛和0.1%的pbs溶液中保存在4c中过夜。

再用-梯度脱水，接下来用环氧树脂浸透并切成薄片。随后超薄切片用铜网固定，后用重金属-双氧-和柠檬酸铅染色。通过tem分析凋亡细胞内超微结构变化，拍照保存。

贴壁细胞:先倒出培养液，采用胰蛋白酶-或者用细胞刮(会产生碎屑)刮下:带培养液进行离心，100-1500/mim 5 10min。离心完毕倒出培养液。分选后的细胞能直接用于培养、移植、-提取、单细胞pcr扩增或原位杂交等，可进一步进行细胞基因、蛋白、功能水平的研究和不同细胞之间的差异化研究。管底的细胞团不要打散， 沿管壁倒入适量(一般为材料体积的5-10倍)的2.5-3.5%成醒固定液，固定约1h-2h. 也可在4c冰箱过夜。

透射电镜观察自噬小体方法

利用光学显微镜，借助相应的染色方法，可以观察细胞凋亡时会出现的一系列形态特征。常用的染色法包括台盼蓝、橙 / 化乙啶（ao/eb）、giemsa 和 he 法等。在光学显微镜下可以观察到核固缩、质浓缩和凋亡小体等典型的凋亡现象。

电镜形态学观察法是一种比较-、-的方法，被认为是确定细胞凋亡的金标准。电镜下凋亡细胞表现为染色质凝集、核浓缩、核裂解、胞浆收缩和胞膜具有发泡现象及凋亡小体出现等。

杂交瘤细胞基因测序

杂交瘤细胞有丢失高特-高活性的风险，或者细胞状态不好乃至。而经过杂交瘤测序，可以获得相应的序列，可以以重组蛋白的方式来稳定获得；从而使得研发或生产者不必以杂交瘤细胞为载体保留该，而可以以碱基序列的形式进行保存和传播交流、鉴定。同时还可以使用获得的测序结果进行等-方面的申请审批。有时为了进一步-生产或进行人源化等生物工程操作/修饰，有-了解杂交瘤所表达的对应的基因序列以进一步进行生物工程操作与生产。血管生成（angiogenesis）是指源于已存在的mao细血管和毛xi血管后微静脉新的mao细血管性血管的生长。

相较于直接对进行基于蛋白质分析的测序相比，得益于基因测序技术的发展，杂交瘤测序可以提供的结果，防止蛋白测序中如亮氨酸/异亮氨酸较难区分等潜在风险。

大鼠脂肪的分离

 将手术切取的大鼠脂肪组织尽量剪碎后移至离心管，其余步骤与人脂肪的分离一致。

 经手术切除获得的大鼠皮下脂肪组织-后原代培养24 h，且肉眼观察会发现培养瓶底部贴附着一层网状薄膜，轻轻摇晃培养瓶可使这层网状薄膜从瓶壁上脱落，镜下观 察发现大部分细胞都附着于这层膜上，通过术获取的人脂肪组织-后则无此现象。增加胶原酶的量和-时间也无法避免，取材时的或脂肪间结缔组织未被完全-，穿过细胞筛进入了培养瓶并沉淀于瓶底部形成的。胶原蛋白酶虽然可以特-水解胶原蛋白的三维螺旋结构，但不会损伤其他蛋白质。处理方法是37 ℃下用胰蛋白酶 -5 min。然后利用40 μm的细胞筛过滤后传代。 根据作者的经验，每毫升手术切除的大鼠脂肪可分离基质血管成分细胞约1.81×106个。5ml含不同浓度（104-106/ml）的细胞悬液，置37℃，5％co2条件下孵育2-4h，弃掉培养液，pbs-t洗涤3次，每次3min。原代培养2.24×10^7个大鼠基质血管成分细胞，40 h后传代时约剩余 6.2×10^6个细胞，细胞剩余率27%。