对于生长的组织培养液中的细胞,首先移除培养基,然后加入0.1m hcl处理细胞。孵育10分钟并观察细胞是否被裂解;如果裂解不充分,接着孵育10分钟并观察。以大于600g离心力于室温离心,收集上清直接用于实验。临用前在0.1m hcl中加入0.1%至1%浓度的triton-x 100可增强细胞和组织裂解。在这个浓度范围内,去污剂并不干扰试验的结合部位,但是会适度的增加光密度值。含有triton的样品需利用标准曲线估计浓度,为了较精l确的测定,标准曲线需以相同方式稀释。取1 ml细胞培养上清加入10μl浓-,600g离心力于室温离心,上清液直接用于实验测定分析。
样品中camp浓度有多种计算方法。x轴表示camp标准品浓度,y轴表示净光密度的平均值或者百分比值。
1 样品和标准品的净光密度(od)平均值的计算:
净od平均值 = od平均值 - nsb孔od平均值
2 计算不同梯度浓度标准品的结合率占较大结合率(b0孔)的百分比,计算公式 如下:
百分比值 = (净od平均值/ b0孔od平均值)×100
3 绘制净od平均值或百分比值对camp标准品浓度的logit-log曲线。通过插值即可得到样品中camp浓度。
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体外用gtpγs/gdp处理蛋白以用作阳性和阴性的对照
注意:在细胞体内环境条件下大约有10%的ras被激l活,而在体外用gtpγs处理大约有90%的ras被激l活。
1.
准备两个离心管,每个管中各加入0.5 ml的细胞提取物(如果是纯的ras蛋白则每个管中加入的蛋白量为1ug)。
2.
每个管中加入20ul 0.5m edta(终浓度即为20 mm)。
3.
一个管中加入5ul的100x gtpγs(终浓度即为100 um)作为阳性对照。另一个管中加入5ul的100x gdp(终浓度即为1 mm)作为阴性对照。
4.
将离心管置于30°c条件下反应30 min并不断搅动。
5.
终止反应:将管置于冰上并加入32.5ul 1m mgcl2(终浓度即为60mm)。
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